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BalbCell非程序细胞冻存液(干细胞专用，GMP级)采用渗透性保护剂、非渗透性保护剂、细胞沉降稳定剂、细胞膜保护剂组合的方案对细胞进行全方位低温保护，可使冻存过程中溶液冰点降低，提高细胞膜对水的通透性，使细胞内水分在冻结前透出细胞，防止或减少冰晶对细胞的损伤，同时降低冰冻时细胞周围电解质浓度，避免电解质损伤，还可以延缓冻存过程中细胞的互相挤压，保护细胞膜，从而有效提高细胞复苏率和活力。

传统的细胞冻存液是使用培养基、血清和DMSO按照一定的比例混合，因其中的血清成分复杂、批次差异大等缺点，其应用具有局限性，且需要采用程序性降温的冻存方法，费时费力。BalbCell非程序细胞冻存液(干细胞专用，GMP级)是一款Serum-Free、Animal Origin-Free、Protein-Free、Chemically Defined，不需要程序性降温的冻存液。与传统细胞冻存液相比具有明显优势(表1)，冻存细胞复苏后的存活率也有明显提高(详情请见产品数据展示)。

BalbCell非程序细胞冻存液(干细胞专用，GMP级)推荐用于各种常规哺乳动物细胞的冻存，尤其适合于无血清培养的干细胞、免疫细胞、蛋白表达细胞的冻存。

• 安全——无血清，无动物源成分，无蛋白，化学成分明确。
  
• 高效——有效提高细胞复苏存活率，大部分细胞(包括间充质干细胞)复苏率可达90%以上。
  
• 稳定——不影响干细胞表型和生长状态，且可维持干细胞的多分化性。
  
• 便捷——即用型产品，且无需程序性降温，可直接-80℃过夜后转移至液氮中长期保存。
  
• 质优——严格的质量控制，产品性能媲美进口；原料均选用自产或者经过严格检测和纯化的低内毒素高纯药用级别原料；注射用水配置，符合GMP规定生产，工艺稳定，批差异小。进口材质无菌包装瓶，符合GMP管理规定，优秀的密闭性及内部涂层保护，极大的保证了产品的稳定性。
  
• 可靠——已有干细胞、免疫细胞、肿瘤和转化细胞系等多种细胞的冻存应用。

• 本品仅供体外诊断使用，请按照说明书的使用方法正确操作；
  
• 本产品为无菌包装，无需过滤，请于无菌环境中取用，开封后应置于2～8℃保存，避免微生物污染；
  
• 培养过程要求细胞培养条件为37℃，5%CO2，饱和湿度，否则会影响培养质量；
  
• 从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞，在冻存前一天最好换一次培养液；
  
• 冻存过程中，在将冻存液加入到细胞之后，请尽量在冰袋附近操作，因为低温可以避免保护剂对细胞造成损伤；
  
• 请保证细胞冻存管完全密封，避免在复苏过程中冻存管炸裂；
  
• 理论上，本产品适用于各种哺乳动物细胞的冻存，但因细胞系种类繁多，无法逐一验证，因此我们推荐您在第一次使用本产品之前，先对所冻存的细胞进行至少为期1周的试验性细胞冷冻保存培养，确认性能后再进行正式冻存；
  
• 将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；
  
• 冻存和复苏最好用新配制的培养液；
  
• 产品使用过程中如接触皮肤需及时用水冲洗；
  
• 所产生的废弃物应参照地方法规要求与细胞样本统一进行销毁处理；
  
• 生产日期、失效日期见试剂盒标签。严禁使用过期产品。

• 贴壁细胞制备细胞悬液：(悬浮细胞请忽略此步骤)
  
  • 将旧培养基吸除，用PBS清洗两遍。
    
  • 在培养瓶中加入少许胰酶，以能覆满瓶底为限。将培养瓶平置于培养箱中消化约1～2分钟，期间在显微镜下观察，一旦发现细胞间隙增大、细胞变圆、比较松动后，立即终止消化(个别难消化细胞需要延长消化时间，但要避免消化过度)。
    
  • 加入适量温浴好的完全培养基终止消化，轻轻吹打混匀细胞。
• 贴壁细胞和悬浮细胞的冻存：
  
  • 取少量细胞悬液进行计数，算出细胞总数和所需细胞保存液的量。细胞的冻存密度以1×10⁶～2×10⁷cells/ml为宜。
    
  • 将所需量的细胞悬液转移至适当离心管中，200～500×g，离心3～5分钟，弃上清收集细胞。(离心速度和时间取决于细胞类型)。
    
  • 向细胞沉淀中加入适量细胞保存液，轻轻吹打以重悬细胞，分装于无菌细胞冻存管中，严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。
    
  • 直接置于-80℃冰箱中储存，细胞可至少保存一年；或者-80℃过夜后，次日将细胞投入液氮中长期储存。

• 自液氮罐或-80℃冰箱中取出冻存管，检查盖子是否旋紧，立即放入37℃水浴中快速解冻(避免冰晶重新结晶而造成细胞死亡)，轻摇冷冻管使其在1～2分钟内全部融化，以75%酒精擦拭冻存管外部，移入无菌操作台内。
  
• 将解冻的细胞悬液移至15mL无菌离心管中，再加入5～10mL预热好的完全培养基，轻轻混合均匀，200～500×g，离心3～5分钟，弃上清收集细胞。(离心速度和时间取决于细胞类型)
  
• 加入预热好的完全培养基，混合均匀，转移到细胞培养皿或培养瓶中，置于细胞培养箱中培养。

• 细胞复苏存活率
  BalbCell组与进口C品牌无血清冻存液组在大部分细胞上存活率是相当的，在有些细胞上BalbCell组的存活率更高(图1&2)。
  
  图1．用BalbCell非程序细胞冻存液(干细胞专用，GMP级)、进口C品牌无血清冻存液、程序性冻存液(20%FBS+10%DMSO)在-80℃中冻存3～17天的多种细胞复苏后存活率比较。
  
  图2．用BalbCell非程序细胞冻存液(干细胞专用，GMP级)、进口C品牌无血清冻存液、程序性冻存液(20%FBS+10%DMSO)在-80℃冻存3个月的多种细胞复苏后存活率比较。
  
• 间充质干细胞复苏后贴壁情况
  细胞复苏后将细胞数调整至1×10⁵/ml，UC-MSC用无血清培养基培养，BM-MSC用DMEM-L+10%FBS培养，24h后换液并观察细胞贴壁情况。BalbCell组比进口C品牌无血清冻存液组贴壁部分细胞更多(图3)，冻存后不会影响间充质干细胞的贴附能力。
  
  图3．BalbCell非程序细胞冻存液(干细胞专用，GMP级)、进口C品牌无血清冻存液、程序性冻存液(20%FBS+10%DMSO)冻存间充质干细胞复苏后细胞贴壁情况的比较。
  
• 细胞复苏后生长状态
  细胞复苏后培养48h，观察生长情况。BalbCell组与进口C品牌无血清冻存液组相比，细胞状态相当甚至更好(图4)，冻存后不会影响间充质干细胞和其他贴壁细胞的生长。
  
  图4．用BalbCell非程序细胞冻存液(干细胞专用，GMP级)、进口C品牌无血清冻存液、程序性冻存液(20%FBS+10%DMSO)冻存间充质干细胞和其他细胞系复苏后细胞生长状态的比较。
  
• 对间充质干细胞标志物表达的影响
  细胞复苏并传代两次后通过流式细胞术评估细胞标志物的表达。BalbCell组能够维持CD105和CD90的阳性表达，和CD45阴性，没有观察到与程序性冻存液组标志物表达的差异(图5)。
  
  图5．用BalbCell非程序细胞冻存液(干细胞专用，GMP级)、程序性冻存液(20%FBS+10%DMSO)冻存人脐带间充质干细胞复苏后细胞标志物的表达。
  
• 对间充质干细胞分化潜能的影响
  BalbCell冻存的细胞保留了三系分化潜能，成脂肪分化细胞形成可见的脂质空泡，呈现出典型的成脂分化；成骨分化细胞形成大量的钙结节，呈现典型的成骨分化；软骨细胞球体的切片和染色证明了硫酸软骨素和硫酸胶质等蛋白的存在，呈现典型的成软骨分化(图6)。
  
  图6．用BalbCell非程序细胞冻存液(干细胞专用，GMP级)冻存的人脐带间充质干细胞分化潜能的鉴定。将复苏后的MSC分化成(A)脂肪细胞、(B)骨细胞和(C)软骨细胞，分别用(A)油红O，(B)茜素红和(C)阿利新蓝进行染色。